Spahn Gruppe
Willkommen auf der Seite der Forschungsgruppe "Nanoscale Bacteriology"!
Im Nanoscale Bacteriology Lab untersuchen wir die molekulare Organisation von Bakterien. Hierzu verwenden wir verschiedene Mikroskopie-Methoden, allen voran Höchstauflösende Mikroskopie. Diese Gruppe von Mikroskopiemethoden ermöglicht es, Bilder von biologischen Proben und Strukturen mit einer Auflösung von wenigen Nanometern zu erzeugen. Im Vergleich zu konventioneller Lichtmikroskopie (z.B. Weitfeld- oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie) stellt dies eine Auflösungsverbesserung um den Faktor 10 - 30 dar. Dies ermöglicht uns, Proteine, Nukleinsäuren und andere Biomoleküle auf nahezu molekularer Ebene und im Kontext intakter, einzelner Zellen zu untersuchen.
Da die Möglichkeiten für die mehrfarbige Höchstauflösende Fluoreszenzmikroskopie in Bakterien begrenzt sind, etablieren und entwickeln wir Methoden, die die gleichzeitige Visualisierung verschiedener Ziele ermöglichen. Dazu gehören Einzelmolekül-basierte Techniken (Single-molecule localization microscopy, SMLM), STED-Mikroskopie und Lebendzell-Mikroskopie. In Verbindung mit künstlicher Intelligenz liefern diese Markierungs- und Bildgebungsverfahren umfangreiche Informationen zu diversen biologischen Fragestellungen. Wir sind auch an der Entwicklung intelligenter Mikroskopieverfahren interessiert, welche z.B. Hochdurchsatzmikroskopie im Bereich der Wirkstoffentdeckung verfeinert und beschleunigt.
Biologisch liegt ein Hauptaugenmerk der Gruppe auf der Untersuchung der Transertion. Transertion beschreibt eine Kopplung von Transkription, Translation und Insertion von Membranproteinen, ein postulierter aber noch unzureichend aufgeklärter Mechanismus, der die bakterielle chromosomale DNA (das sogenannte Nukleoid) dynamisch mit der Bakterienmembran verbindet. Da Bakterienzellen winzig sind, erfordert die Untersuchung dieses Prozesses eine räumliche Auflösung im Nanometerbereich. Durch systematische Störungen der zellulären Prozesse mit Antibiotika konnte gezeigt werden, dass die Proteinbiosynthese stark zur Organisation des bakteriellen Nukleoids beiträgt. In unserer zukünftigen Arbeit wollen wir die molekularen Mechanismen hinter dieser Organisation entschlüsseln, sowohl in unserem Modellorganismus Escherichia coli, als auch in gram-negativen Krankheitserregern.
Insgesamt ermöglicht unser breites Methodenspektrum zukünftig die Untersuchung diverser weiterer biologischer Fragestellungen. Hierzu gehören unter Anderem:
- Aufbau bakterieller Biofilme
- Mikrobielle Resistenzmechanismen
- Pathogen-Wirtszell-Interaktionen
Höchstauflösende Fluoreszenzmikroskopie
Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM)
Ein Schwerpunkt unserer Forschung ist die Entwicklung von höchstauflösenden Mikroskopiemethoden, insbesondere für den Einsatz in der Mikrobiologie. Wir verwenden hauptsächlich die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) (Abb. 1), bei welcher das Fluoreszenzsignal zeitlich aufgetrennt wird und einzelne Farbstoffmoleküle (Emitter) mit hoher Präzision lokalisiert werden können. Aus den Koordinaten vieler Moleküle wird ein künstliches Bild mit >10-fach verbesserter Auflösung und erhöhtem Kontrast rekonstruiert.
Insbesondere haben wir Werkzeuge entwickelt, um die Organisation chromosomaler DNA (das ‚Nukleoid‘) in fixierten Bakterienzellen zu untersuchen. Ausgehend von einem EdU-basierten metabolischen Markierungsansatz in Kombination mit direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) [1] sind wir zu reversibel bindenden Sonden übergegangen, die für Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography (PAINT) verwendet werden können [2]. Zusammen mit dem Labor von Luke Lavis (Janelia Farm, USA) haben wir eine Palette von DNA- und membranbindenden PAINT-Sonden getestet, die eine multiplexe Bildgebung des Nukleoids und der Membranen in verschiedenen Farbkombinationen ermöglichen. Dieser einfache Ansatz ist sehr vielseitig und ermöglicht höchstauflösende Bildgebung unabhängig von aktiver Replikation. Wir konnte damit zeigen, dass das Nukleoid von E. coli während schnellen Wachstums stark strukturiert ist und dass es sich in unmittelbarer Nähe der inneren Membran befindet [3].
Kürzlich haben wir diesen Ansatz genutzt, um die Reaktion des E. coli-Nukleoids auf Störungen zu untersuchen. Höchstauflösende Messungen von Antibiotika-behandelten Zellen zeigten eine schnelle Reorganisation des Nukleoids, insbesondere während der Hemmung der Transkription und Translation. Wir glauben, dass dies auf die Transertion zurückzuführen ist, die dynamische Kopplung von Transkription, Translation und Membraninsertion/Translokation von Proteinen [4].
SMLM erlaubt die Visualisierung verschiedener biologischer Strukturen (Abb. 2). Die Kombination dieser Techniken in Mehrfarben-Mikroskopie gibt scharfe Einblicke in die Organisation einzelner Bakterienzellen.
STED Mikroskopie
Hochwertige Einzelmolekül-Bildgebung erfordert eine robuste räumliche und zeitliche Trennung des Fluoeszenzsignals. Dies ist jedoch bei heterogenen Strukturen, die sowohl Bereiche mit starker als auch schwacher Dichte aufweisen, eine Herausforderung. Als Alternative zu SMLM haben wir die Verwendung von transient bindenden Sonden in hoher Konzentration untersucht. Eine ausreichend hohe Konzentration von PAINT-Sonden (typischerweise 100 – 500 nM) sorgt für eine pseudo-permanente Markierung, die effizient für die STED-Bildgebung genutzt werden kann [5]. Der ständige Austausch der Markierungen umgeht Probleme durch Photobleichen, welches oft ein limitierender Faktor für eine hochwertige STED-Mikroskopie ist.
Die optische Sektionierung in der STED-Mikroskopie umgeht das Problem des hohen Hintergrunds durch die Verwendung nicht-fluorogener Sonden. Wir haben das Konzept der STED mit austauschbaren Markern erfolgreich auf Sonden wie Lifeact und fluoreszenzmarkierte DNA-Oligos angewendet, wie sie in DNA-PAINT verwendet werden [5, 6]. Wir glauben, dass dieses Konzept auf alle Marker verallgemeinert werden kann, die bestimmte kinetische Eigenschaften erfüllen (hohe nM- bis niedrige µM-Affinität, hohe On- und Off-Raten).
Chromosomenorganisation in Bakterien
Unser größtes biologisches Interesse gilt der Organisation des bakteriellen Chromosoms. Uns fasziniert die morphologische Vielfalt des Nukleoids und die molekularen Mechanismen, welche der Replikation, Segregation und 3-dimensionaler Anordnung bakterieller Chromosomen zu Grunde liegen.
Die Morphologie des Nukleoids ist stark abhängig von externen und internen Faktoren, darunter das Nährstoffenangebot, Temperatur, Zelldichte oder das Vorhandensein bestimmter Wirkstoffe (z. B. Antibiotika, Toxine). Die geringe Größe des Nukleoids macht es zu einem idealen Ziel für höchstauflösende Mikroskopie, mit welcher wir dessen Verteilung und Morphologie mit einer Auflösung von ~30 nm abzubilden können. Dies erlaub es, subtile Unterschiede der Chromosomenorganisation unter verschiedensten Bedingungen aufdecken (Abb. 4).
Einige Antibiotika haben beispielsweise einen starken Einfluss auf die Zellform sowie die Verteilung der DNA innerhalb der Zelle (Abb. 4A) [3]. Dies macht man sich in bildbasierter Wirkstoffscreening zu Nutze, in welchem die unterschiedlichen Phänotypen als Indikator für die grobe Wirkungsweise (MoA) von Wirkstoffen dienen können. Wir denken, dass eine stark verbesserte Auflösung eine detaillierte Bewertung der Wirkungsweise von Antibiotika ermöglichen.
In Kollaboration mit Helge Bode (MPI für Terrestrische Mikrobiologie, Marburg) haben wir z.B. die Verteilung des antimikrobiellen Peptids PAX (Peptide Antimicrobial Xenorhabdus) untersucht (Abb. 4B) [7]. Höchstauflösende Aufnahmen zeigten so, dass das Peptid sowohl das Zytosol von E. coli Zellen flutet, als auch deren Membran solubilisiert.
Referenzen
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