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Rudolf-Virchow-Zentrum für Experimentelle Biomedizin

Bildgebende Verfahren

Bitte beachten Sie unsere Nutzungsordnung / interne Nutzungsordnung 
und Gebührenordnung

Ansprechpartnerin:  
Dr. Katrin Heinze
Tel.: +49 (0)931 31-84214
E-Mail: katrin.heinze@virchow.uni-wuerzburg.de

Mitarbeiter: Mike Friedrich (Mikroskopie und optische Messtechnik)  

Folgende Technologien und Methoden stehen allen Arbeitsgruppen zur Verfügung:

Hellfeldmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie mit hoher Zeitauflösung und "cell-tracking"

Mittels sogenannter "time-lapse" Mikroskopie können dynamische zelluläre Prozesse, wie die Migration und Invasion von Zellen, die Zytokinese oder Apoptose von Zellen bei 37°C, dargestellt werden. Zwei- wie dreidimensionale Zellkulturen können damit bis zu sieben Tage lang beobachtet werden. Die resultierenden Bildserien werden in eine Filmsequenz übertragen, und die dynamischen zellulären Vorgänge mittels spezialisierter Software-Pakete ausgewertet. So lassen sich Vorgänge, wie z.B. die Migration von Zellen, computergestützt und automatisiert erfassen und quantifizieren (engl.: cell tracking).

Konfokale Fluoreszenzmikroskopie

Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie hat sich zu einer der leistungsstärksten Technologien in den Lebenswissenschaften entwickelt. Im Gegensatz zur Weitfeldmikroskopie ist es mit einem konfokalen Laser-Rastermikroskop (engl.: confocal Laser Scanning Microscope LSM) möglich, aus einer dicken Probe (typischerweise bis 100 μm) ausschließlich eine dünne Präparatschicht, einen sogenannten optischen Schnitt, abzubilden, der typischerweise eine axiale Ausdehnung von weniger als 1µm aufweist.

Für die Beleuchtung wird ein Laser eingesetzt, der in der Fokusebene das Objekt punktweise abrastert und zur Fluoreszenz anregt. Die optische Tiefenschärfe wird durch eine konfokale Blende (pinhole) in der Bildebene erreicht, die bewirkt, dass nur das Licht aus der Fokusebene den Detektor erreichen kann. 

Zur Verfügung stehendes Mikroskop: Leica SP5 mit sichtbaren (405, 458, 476, 488, 496, 514, 561, 594, 633 nm) und IR-Laser-Quellen.

Am Konfokalmikroskop können viele interressante Spezialmethoden und Verfahren der modernen Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Einige sind im Folgenden aufgelistet.

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

Mit Hilfe von FRET lassen sich intra- oder intermolekulare Proteinwechselwirkungen untersuchen. Dafür werden interagierende Proteine oder Molekülgruppen mit zwei verschiedenen Fluorophoren markiert, wobei einer als ‚Donor‘ der zu übertragenden Energie und der andere als ‚Akzeptor‘ dient. Sind die molekularen Bausteine durch Interaktion nahe genug beieinander kann ein Energietransfer zwischen den Fluorophoren stattfinden und dieser mit dem Fluoreszenzmikroskop gemessen werden.

Zur Verfügung stehendes Mikroskop: Leica SP5

Fluoreszenz Lifetime Imaging (FLIM)

Mit dem oben beschriebenen Energietransfer (FRET) ändert sich auch die sogenannte Fluoreszenz-Lebensdauer der interagierenden Moleküle (also die charakteristische Zeit, die zwischen der Anregung und der Emission eines Fluoreszenzphotons liegt). Mit der FLIM-Technik lässt sich die Fluoreszenz-Lebensdauer individueller Biomoleküle in einem konfokalen Fluoreszenzbild pixelweise bestimmen, und somit die FRET-Effizienz (Ein- und Multiphotonen Anregung). 

Zur Verfügung stehendes Mikroskop: Leica SP5

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)

Durch FRAP können dynamische Prozesse in Zellen analysiert werden. Dafür werden fluoreszenzmarkierte Proteine in Zellen so lange mit Laserlicht der passenden Wellenlänge bestrahlt, bis die fluoreszenzmarkierte Stelle „ausbleicht“. Kehrt die Fluoreszenz an diese Stelle zurück, ist das ein Zeichen dafür, dass Moleküle mit ausgebleichtem Farbstoff durch solche mit intaktem Farbstoff durch entsprechende Moleküldynamiken ersetzt werden. Durch Auswertung der Zeitkonstanten können entsprechende Diffusions- oder Transportdynamiken bestimmt werden. (Minimale zeitliche Auflösung: 100ms, Bleich-Areal: 4 x 4 µm oder „single-spot“).

Zur Verfügung stehendes Mikroskop: Leica SP5

Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS)

Für die Messung schneller Diffusions- oder Transportprozesse kann  die FCS eingesetzt werden. Die FCS ist eine statistisches Messverfahren, welches nicht bildgebend ist, sondern sogenannte Korrelationskurven liefert, die es ermöglichen, Molekülkonzentration und schnelle Mobilitätskonstanten zu bestimmen. Der Haupt-Messparameter sind hier Fluoreszenzfluktuationen einzelner Moleküle, die sich durch den fokussierten, stationären Laserstrahl bewegen und beim Durchtritt fluoreszenzangeregt werden. 

Zur Verfügung stehendes Mikroskop: Leica SP5

Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM)

Die Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie erlaubt (bei entsprechender Probenpräparation) dreidimensionale Abbildungen größerer Gewebestücke oder ganzer Organe mit zellulärer Auflösung. Bei der Lichtscheiben-Mikroskopie (engl.: Single Plane Illumination Microscopy oder Selective Plane Illumination Microscopy SPIM) handelt es sich um ein relativ neuartiges fluoreszenzmikroskopisches Verfahren, bei dem nur eine Ebene in der Probe (typischerweise einige mikro- bis millimeter dick) mit Anregungslicht beleuchtet wird. Um die Technik auf ganze Organe anzuwenden, muss das Gewebe zunächst durchsichtig gemacht werden. Dazu dehydrierten wir die Organe und ersetzen das Wasser durch ein Öl, dessen Brechungsindex dem von Protein entspricht. Das Organ erscheint nach der Prozedur gläsern und bewirkt, dass Licht, welches auf das präparierte Gewebe fällt, weniger gestreut wird. 

Zur Verfügung stehendes Mikroskop: Zeiss Axiovert 200, 
Referenz: Huisken, J. et al. (2004). 305, 1007 oder Dodt, H.U. et al., N. Methods , (4) 331.

Zweiphotonen-Mikroskopie

Die Zweiphotonen-Mikroskopie ist ausgerichtet auf die besonders schonende, räumlich und zeitlich aufgelöste Darstellung von Zellen und Gewebsbestandteilen in vitro und in vivo. Vorteile der Zweiphotonenmikroskopie gegenüber herkömmlicher Mikroskopie sind hauptsächlich die erhöhte Tiefenauflösung und Eindringtiefe in Gewebe bis zu 0,5 - 1 mm, da die Anregung der Moleküle im Infraroten erfolgt, also bei einer Wellenlänge, bei der biologischen Proben weitestgehend transparent sind und wenig Licht streuen. Phototoxische Effekte werden reduziert, da die Photozerstörung außerhalb des Anregungsfokus vernachlässigbar ist.

Wir bieten zwei Multi-Photonen-Systeme:

  1. Basierend auf einem inversen Mikroskop (Leica SP5), gut geeignet für das Mikroskopieren von Zellkultur und Gewebe (ex vivo, in vitro)
  2. Basierend auf einem aufrechten (‚fixed stage‘) Mikroskop (LaVision Trimscope), welches für die besonderen Belange der intravital-Mikroskopie geeignet ist.

Beide Systeme bieten einen Wellenlängenbereich für die Anregung der Proben von ca. 700-980 nm (Ti:Sa laser) und 1100-1400 nm (OPO). Wir können deshalb auch sogenannte ‚second and third harmonic‘ (SHG, THG) Mikroskopie durchführen.

STED-Mikroskopie

Ein STED-Mikroskop (STED (engl.): STimulated Emission Depletion) ist auf die räumlich und zeitlich aufgelöste Darstellung von Zellen und Zellkompartmenten ausgerichtet, wobei die räumliche Auflösung typischerweise bis zu 3 mal besser ist als die unserer konfokalen Geräte. Ein STED-Mikroskop basiert zunächst auf einem konfokalen Mikroskop. Zusätzlich wird durch einen gepulsten IR-Laser mit speziellem Anregungsprofil ein physikalischer Trick angewandt, um die Auflösung in Zellen auf bis zu 80 nm zu verbessern. Die zeitliche Auflösung ist ─ wie bei der Konfokalmikroskopie auch ─ von der möglichen Scan-Geschwindigkeit abhängig.

Wir möchten darauf hinweisen, dass nur ausgewählte Fluoreszenzfarbstoffe für die Hochauflösung in unserem STED-Mikroskop geeignet sind (z.B. Atto647)!

Wir bieten ein STED-Mikroskop mit folgenden Merkmalen und Besonderheiten:

1. Inverses Stativ
2. STED-Mikroskopie in einem Farbkanal, ansonsten sind zusätzlich noch bis 
zu 4 weitere konfokale Farbkanäle wählbar.
3. Gepulster STED-Laser, und vier weitere Laserwellenlängen (458-633 nm). 
Achtung: Es ist kein Laser (405 nm) für die DAPI-Anregung verfügbar!

Einzelmolekül-Abbildungen durch Rasterkraftmikroskopie

Ansprechpartner: AG Tessmer

Die Rasterkraftmikroskopie (englisch: atomic force microscopy; AFM) nutzt eine winzige, scharfe Messsonde zur mechanischen Rasterung biologischer Proben. Dabei wird ein topographisches Bild mit einer Auflösung von wenigen Nanometern erstellt, welches es uns ermöglicht, einzelne biologische Moleküle wie etwa Proteine und deren Interaktionen sichtbar zu machen. Durch die hohe Auflösung des AFM in Kombination mit der Anwendbarkeit in flüssigem, physiologischem Medium stellt diese Methode ein komplementäres Verbindungsglied dar zwischen Röntgen-Kristallographie (mit atomaren Auflösungen im Ångstrom-Bereich zur Erlangung struktureller Information von Molekülen) und funktionalen in vitro und in vivo Analysen biologischer Systeme mittels optisch-mikroskopischer Ansätze (mit typischen Auflösungen von ein paar hundert Nanometern).

Mikroskopsystem: Asylum Research MFP-3D

Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM)

Ansprechpartner:  AG Gohla

Die TIRF-Mikroskopie ermöglicht die Untersuchung von dynamischen Prozessen in und nahe der Zellmembran lebender Zellen auf einem Deckglas. TIRF erzeugt ein axial extrem schmales Anregungsfeld in der Probe so dass nur Fluorophore in 70 bis 350 nm über der Deckglasoberfläche angeregt werden. Durch die dünne optische Schichtdicke wird Hintergrundlicht (z.B. durch Fluoreszenz aus dem Zytoplasma oder Zellkern) vermieden und nur die basolaterale Membran von Zellen auf dem Deckglas mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Hierbei können am zur Verfügung stehenden Mikroskop auch FRET-Experimente zur Untersuchung der Protein-Dynamiken in der Plasmamembran durchgeführt werden.

Zur Verfügung stehendes Mikroskop: Leica AM TIRF Mikroskop

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